Heidelberg’deki Max Planck Tıp Araştırma Enstitüsü’nden Nobel Ödüllü Stefan Hell liderliğindeki bilim insanları, bir nanometrelik mekansal ve zamansal hassasiyete sahip bir süper çözünürlüklü mikroskop geliştirdiler. Yakın zamanda tanıttıkları MINFLUX süper çözünürlük mikroskobunun geliştirilmiş bir versiyonu, tek proteinlerin küçük hareketlerinin benzeri görülmemiş bir ayrıntı düzeyinde gözlemlenmesini sağladı: ATP tüketirken mikrotübüller boyunca yürüyen motor protein kinezin-1’in adım atma hareketi. Bu çalışma, proteinlerde nanometre boyutundaki konformasyonel değişiklikleri gözlemlemek için devrim niteliğinde yeni bir araç olarak MINFLUX’un gücünü vurgulamaktadır.
Bir hücrenin iç işleyişini çözmek, tek tek proteinlerin biyokimyası hakkında bilgi sahibi olmayı gerektirir. Konumlarındaki ve şekillerindeki küçük değişiklikleri ölçmek buradaki temel zorluktur. Floresan mikroskobu, özellikle de süper çözünürlüklü mikroskop (yani nanoskop) bu gelişmekte olan alanda vazgeçilmez hale gelmiştir. Yakın zamanda tanıtılan floresan nanoskopi sistemi MINFLUX, küçük organik moleküllerin boyutu olan bir ila birkaç nanometrelik uzamsal çözünürlüğe şimdiden ulaşmıştır. Ancak moleküler hücre fizyolojisi anlayışımızı bir sonraki seviyeye taşımak, daha da yüksek uzaysal-zamansal çözünürlükte gözlemler gerektiriyor.
Stefan Hell’in grubu MINFLUX’u 2016’da ilk kez sunduğunda, hücrelerdeki floresan etiketli proteinleri izlemek için kullanılmıştı. Ancak bu hareketler rastgeleydi ve izleme onlarca nanometre mertebesinde hassasiyete sahipti. Bu çalışma, MINFLUX’un çözümleme gücünü proteinlerin, özellikle de motor protein kinezin-1’in konformasyonel değişikliklerine uygulayan ilk çalışmadır. Bunu yapmak için, Tıbbi Araştırmalar Max Planck Enstitüsü’ndeki araştırmacılar, tekil floresan moleküllerin izlenmesi için yeni bir MINFLUX versiyonu geliştirdiler.
Protein dinamiklerini ölçmek için kullanılan tüm yöntemler, kritik öneme sahip (sub)nanometre/(sub)milisaniye aralığını ele alma yeteneklerini engelleyen ciddi sınırlamalara sahiptir. Bazıları birkaç nanometreye kadar yüksek uzaysal çözünürlük sağlar ancak değişiklikleri yeterince hızlı izleyemez. Diğerleri yüksek zamansal çözünürlüğe sahiptir ancak çalışılan proteinden 2 ila 3 kat daha büyük taneciklerle etiketleme gerektirir. Proteinin işleyişinin bu boyuttaki bir tanecik tarafından tehlikeye atılması muhtemel olduğundan, tanecik kullanılarak yapılan çalışmalar açık sorular bırakmaktadır.
Tekil Bir Molekülden Gelen Floresan
MINFLUX, proteine bağlı bir etiket olarak yalnızca standart 1 nm boyutunda bir floresan molekülü gerektirir ve bu nedenle doğal protein dinamiklerini incelemek için gereken hem çözünürlüğü hem de minimum invazivliği sağlayabilir. Gruptaki doktora öğrencisi Otto Wolff, “Zorluklardan biri, teorik sınıra yakın çalışan ve çevresel gürültüye karşı korumalı bir MINFLUX mikroskobu inşa etmekte yatıyor” dedi. Meslektaşı Lukas Scheiderer ise “Protein işlevini etkilemeyen ama yine de biyolojik mekanizmayı ortaya çıkaran problar tasarlamak da bir diğer zorluk” diye ekledi.
Araştırmacıların tanıttıkları MINFLUX mikroskobu, protein hareketlerini milisaniye başına 1,7 nanometreye kadar uzamsal-zamansal hassasiyetle kaydedebiliyor. Floresan molekülü tarafından yayılan sadece yaklaşık 20 fotonun algılanmasını gerektiriyor.
Stefan Hell, “Bireysel proteinlerin dinamiklerinin ve işlevleri sırasında nasıl şekil değiştirdiklerinin incelenmesinde yeni bir sayfa açtığımızı düşünüyorum” dedi. “MINFLUX tarafından sağlanan yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlük kombinasyonu, araştırmacıların biyomolekülleri daha önce hiç olmadığı gibi incelemesine olanak tanıyacak.”
Kinezin-1’in Fizyolojik Koşullar Altında ATP İle Adım Hareketinin Çözülmesi
Kinesin-1, hücrelerimizde yük taşımada önemli bir rol oynar ve proteinin mutasyonları birkaç hastalığın merkezindedir. Kinesin-1, hücrelerimizde ağ gibi uzanan filamentlerin (mikrotübüller) üzerinde gerçekten ‘yürür’. Proteinin iki ‘başı’ olduğundan, hareketi adım adım düşünebiliriz çünkü bu başlar mikrotübül üzerinde sırasıyla yer değiştirirler. Bu hareket genellikle mikrotübülü oluşturan 13 protofilamentten biri boyunca gerçekleşir ve hücrenin temel enerji tedarikçisi ATP’nin (adenozin trifosfat) parçalanmasıyla beslenir.
Kinezin-1’i etiketlemek için sadece tek bir florofor kullanan bilim insanları, nanometre/milisaniye uzay-zamansal çözünürlükle, tek tek başların düzenli 16 nm’lik adımlarının yanı sıra 8 nm’lik alt adımları da kaydetti. Elde ettikleri sonuçlar, mikrotübüle tek bir baş bağlı olduğunda ATP’nin yakalandığını ancak her iki baş bağlı olduğunda ATP hidrolizinin meydana geldiğini kanıtlamıştır. Ayrıca adım atmanın, kinezin molekülünün yükü tutan kısmı olan protein ‘sapının’ dönmesini içerdiğini ortaya koydu. MINFLUX’un uzaysal-zamansal çözünürlüğü ayrıca her bir adımın ilk aşamasında başın döndüğünü ortaya çıkarmıştır. Daha da önemlisi, bu bulgular şimdiye kadar küçük floresan etiketlerle mümkün olmayan fizyolojik ATP konsantrasyonları kullanılarak elde edilmiştir.
Protein Dinamiklerinin Araştırılmasında Gelecekteki Potansiyel
Daha önce Hell’in grubunda doktora sonrası bilim insanı olan ve şu anda MINFLUX’un çeşitli biyolojik sorulara uygulamalarını araştıran Jessica Matthias “MINFLUX’un bizi nereye götüreceğini görmek beni heyecanlandırıyor. Proteinlerin nasıl çalıştığına dair çalışmalara başka bir boyut katıyor. Bu, birçok hastalığın arkasındaki mekanizmaları anlamamıza ve nihayetinde tedavilerin geliştirilmesine katkıda bulunmamıza yardımcı olabilir” diye ekledi. [1]Major advance in super-resolution fluorescence microscopy[2]Öne çıkan görsel
[cite]
Kaynaklar ve İleri Okuma
| ↑1 | Major advance in super-resolution fluorescence microscopy |
|---|---|
| ↑2 | Öne çıkan görsel |
